Sessão I da CHDI terapêutico de conferência: organização de Seminários por Gill Bates & Judith Frydman

Gill Bates da University College London, descreveu seu trabalho no splicing incompleto do gene Htt e as implicações dessas descobertas para o desenvolvimento terapêutico. O produto de splicing que ela identificou levou à produção de uma proteína exon-1 pura, que no contexto da expansão CAG é muito tóxica. Seu trabalho recente se concentrou em determinar, no contexto de modelos de camundongos knock-in, se esse produto anormal emendado (que só ocorre em função da expansão) contribui significativamente para o início e a progressão da doença nos modelos de roedores comumente usados ( e por extensão, à doença humana). É bem conhecido que o exon-1 é muito propenso à agregação e, portanto, isso pode iniciar a patologia da doença encontrada na DH humana e em modelos de camundongos.

Existem algumas evidências de que esse processamento anormal pode ocorrer em amostras humanas, mas as evidências atuais são mais fortes para os casos pediátricos de HD, onde o comprimento do CAG é maior. Isso também foi demonstrado em fibroblastos de pacientes e por no local estudos de hibridização (ISH) em núcleos humanos, onde seu laboratório pode detectar a expressão desse produto de mRNA. em todos os modelos de camundongos, ela pode detectar a proteína exon-1 pura pelo uso de combinações de anticorpos que detectam especificamente a proteína exon-1 (o anticorpo MW8 é capaz de reconhecer apenas uma sequência de proteína exon-1 pura que termina em um resíduo de prolina, e não no contexto da proteína gerada a partir do transcrito de mRNA de comprimento total; portanto, MW8 é considerado um anticorpo de ligação de 'neo-epítopo').

Gill descreve vários novos ensaios baseados em anticorpos HTT mutantes para rastrear a progressão da patologia agregada em modelos de camundongos KI, incluindo o monitoramento da agregação do exon-1. A agregação do produto exon-1 não parece alterar os níveis completos de HTT usando ensaios padrão. Usando esses ensaios, seu laboratório agora conseguiu mostrar que, em um modelo de camundongo, uma sequência de DNA de 20 kb no íntron-1 é excluída por meio da edição crispr de um modelo KI, o camundongo HdhQ150. Neste camundongo, o produto de proteína pura do exon-1 produzido por extravio é reduzido em 80-90%, sem alterar os níveis da proteína HTT de comprimento total. É importante ressaltar que a patologia agregada é muito diminuída (aparece, mas muito atrasada; 3 vs 17 meses de idade em qualquer modelo) quando o evento de plicing incorreto é prevenido geneticamente. Endpoints adicionais, como RNAseq e estudos de éforos SPN estriatais, estão em andamento, mas ainda não foram concluídos.

Ela então passou a monitorar a agregação conduzida pelo exon-1 puro no modelo de camundongo YAC128 humanizado e descobriu que a agregação mais precoce e profunda é encontrada no cerebelo a partir dos 3 meses de idade. Ela então passou a usar ISH para detectar o transcrito HTT completo versus o mRNA mal colocado do exon1a, e descobriu que eles formavam 'inclusões' ou 'focos' dentro do núcleo de neurônios que podem ser patogênicos, já que não contêm HTT normal de camundongo. Esses 'focos' parecem ocorrer apenas em um contexto humano, não nos modelos de camundongos KI, sugerindo que as sequências do íntron-1 humano são provavelmente responsáveis pela retenção desse mRNA no núcleo. Ela concluiu sua palestra resumindo sua hipótese para o mecanismo de patogênese devido a misplicing ou proteólise.

Judith Frydman da Universidade de Stanford falou sobre outro aspecto da biologia do HTT envolvendo o controle translacional dos níveis de proteína HTT e o papel do mHTT na resposta ao estresse nas células cerebrais. Judith aqui defende um novo mecanismo que pode contribuir para a patogênese da doença, que pode explicar por que na DH há tantas coisas erradas com as células cerebrais. Ela está se concentrando no papel das alterações ribossômicas na DH e no papel do HTT na biologia ribossomal. Os níveis e o destino das proteínas são determinados pela taxa de alongamento do ribossomo. O exon-1 do HTT contém as repetições de poliprolina, que atuam como sequências de paralisação da tradução e são muito difíceis de traduzir, retardando a tradução. Além disso, o HTT possui um quadro de leitura micro-aberto (uORF) no 5' UTR do gene HTT, que é conservado em mamíferos. uORFs regulam a tradução e são tipicamente implicados na regulação gênica pela resposta celular ao estresse. Judith afirma que o HTT é um gene de “resposta ao estresse”. Ela mostra que o eIF2a-P é um evento que regula a tradução HTT em resposta a muitas pistas potenciais, inclusive nos dendritos e terminais axônicos.

Usando uma técnica chamada 'perfil de ribossomo', ela mostra que tanto o uORF quanto o ORF principal (codificando HTT) são ligados por ribossomos de tradução, e a extensão da ocupação por ribossomos pode ser modulada por sinais de estresse. A expressão do HTT é induzida pelo estresse em vários contextos celulares, incluindo neurônios primários. O estresse ignora o uORF e desloca a tradução para o ORF principal.

Judith então postulou que esse processo - a regulação positiva de HTT via uORF e estresse - poderia ser determinante dos níveis de proteína e do processo de agregação. Portanto, o uORF controla os níveis de proteína HTT sendo produzidos.

Em um contexto de HD, as colisões são observadas de maneira dependente do comprimento do CAG, usando um sistema artificial, onde a expressão viral de construtos HTT expressando o exon-1. Usando puromicina, que induz parada translacional, ela estuda o impacto da repetição CAG nas colisões. As colisões podem ser reconhecidas por um controle de qualidade do ribossomo (RQC) e ativam diversas vias de sinalização, como resposta a esse evento, sinalizando que a célula está com um grande problema. Seu laboratório então conduziu estudos proteômicos usando o sistema de polissomas virais expressando o exon-1, e eles mostraram que muitas E3 ligases são encontradas alteradas neste sistema devido à paralisação do mHTT, incluindo a depleção de eIF5a, levando ao término prematuro da tradução.

Os níveis de eIF5a diminuem nos cérebros de modelos de ratinhos com DH, e isto é suportado pelos níveis de ubiquitinação da subunidade do ribossoma, que indicam um défice da função do ribossoma. Além disso, os mecanismos proteostáticos são afetados no início do processo da doença. Judith afirma que a perda da expressão do eIF5a é crítica para a patologia na DH, por meio de um mecanismo de tradução. Ela acha que essa é uma abordagem terapêutica válida, por meio da modulação do alongamento translacional.